Arrêté
n°2000-0728/PR/MAEM relatif aux critères microbiologiques auxquels doivent
satisfaire certaines denrées animales ou d'origine animale.
LE
PRESIDENT DE LA REPUBLIQUE, CHEF DU GOUVERNEMENT
VU
la Constitution du 15 septembre 1992 ;
VU
la délibération N° 472/6° L portant règlement d'hygiène et de voirie ;
VU
la loi N° 154/AN/85 1ère L du 11 juin 1985 portant organisation de
l'administration du Ministère de l'Agriculture et du Développement Rural ;
VU
la loi N° 63/AN/89/2ème L du 03 avril 1989 modifiant la Loi 154/AN/85/1ère L
du 11 juin 1985 portant organisation de l'administration du Ministère de
l'Agriculture et du Développement Rural
VU
le décret N° 99-0059/PRE du 12 mai 1999 portant nomination du Gouvernement et
fixant leurs attributions ;
Sur
proposition du Ministre de l'Agriculture, de l'Elevage et de la Mer, chargé des
Ressources Hydrauliques ;
Le
Conseil des Ministres entendu en sa séance du 19 septembre 2000 ;
ARRETE
Article
1er :
Pour
être reconnues propres à la consommation, les denrées animales ou d'origine
animale, ci-après énumérées doivent satisfaire aux critères
microbiologiques fixés au présent arrêté et vérifiés selon les
dispositions décrites en annexes. En outre, elles doivent être exemptes de
micro-organismes ou toxines dangereuses pour la santé publique.
*Viandes
de boucherie;
*Viandes
hachées à l'avance, viandes cuites, produits de charcuterie, quenelles, plats
cuisinés à l'avance, potages déshydratés;
*Viandes
de volaille;
*Produits
de la pêche;
*Ovoproduits,
pâtisserie, crèmes pâtissières;
*Laits
fermentés (yaourts, kéfir.), laits gélifiés, fromages frais pasteurisés, crèmes
fraîches pasteurisées,
glaces
et crèmes glacées, caséine et caséinates;
*Conserves
à base de denrées animales ou d'origine animale;
*Semi-conserves
à base de denrées animales ou d'origine animale;
Article
2 :
Au
sens de l'article 1er , les critères microbiologiques relatifs aux viandes de
boucherie sont les suivants :
Désignation |
Micro- organismes aérobies à 30°C (par gramme) |
Coliformes fécaux (par gramme) |
Staphylocoques pathogènes (par gramme)
|
Anaérobies Sulfito- réducteurs à 46°C (par gramme)
|
Salmonelles dans 25 grammes |
Carcasses
ou coupes de demi-gros,
réfrigérées ou
congelées
(1) Pièces
conditionnées sous vide ou non, réfrigérées ou
congelées (1)
Portions
unitaire conditionnées, réfrigérées
ou congelées et portions
unitaires du commerce de
détail réfrigérées ou
congelées
(2)
|
(3) 5.10²
4 (3) 5.10
- |
-
10²
3.10² |
-
-
10² |
2
2
10 |
Absence
Absence
Absence |
(1)
Le prélèvement est effectué en profondeur, après cautérisation de la
surface.
(2)
Le prélèvement concerne profondeur plus surface sans caurérisation.
(3) Seules les tolérances de caractère analytique sont acceptées (plan à deux classes).
Article 3 :
Les
critères microbiologiques relatifs aux viandes hachées, aux viandes cuites,
aux produits de charcuterie, aux plats cuisinés et aux potages déshydratés
sont les suivants :
Désignation |
Micro- organismes aérobies à 30°C (par gramme)
|
Coliformes à 30°C (par gramme) |
Coliformes fécaux (par gramme) |
Staphylos pathogènes (par gramme)
|
Anaéro- bies Sulfito- réducteurs |
Salmonelles dans 25 grammes |
- Viande hachée à l’avance ou à la demande
- Plats cuisinés à l’avance, escargots préparés, pièces de viandes ou non - Produits de crus, haché :
* Soumis à à consommer en
l’état * à Consommer après cuisson - Produits de salaison crus ou salés et/ou séchés, tranchés ou non -Produit
de charcuterie cuits, tranchés ou non, quenelles - Jambon cru - Potages
|
5 5.10
5 (2)3.10
-
-
(3) -
5 (2)(3)3.10
4 10 5 3.10
|
10²
-
-
-
3 10
10 3 10 |
10²
10
10²
3 10
3 10
10
Absence
10 |
10²
10²
5.10²
3 10
5.10²
10²
Absence
10² |
(1)30
30
50
10²
50
30
Absence
30 |
Absence
Absence
Absence
Absence
Absence
Absence
Absence
Absence |
(1)
Tolérance prévue en annexe comprise.
(2)
Pour les pâtes farcies du type ravioli, cannelloni, lasagne, les quenelles et
les plats cuisinés auxquels est incorporé du fromage, ce critère doit être
interprété.
(3)
Pour les produits de charcuterie conditionnés sous pellicule plastique et sous
vide, le critère relatif aux micro-organismes aérobies à 30°C (3.105) par
gramme ne s'applique qu'au stade de la fabrication (usine).
Article
4 :
Les
critères microbiologiques relatifs aux viandes de volailles sont les suivants :
Désignation
|
Micro- organismes aérobies à 30°C (par gramme) |
Coliformes
Fécaux
(par gramme)
|
Staphylo- coques aureus (par gramme) |
Anaérobies
Sulfito-réducteurs
à 46°C |
Salmonelles |
Volailles
entières réfrigérées, Rôtis, escalopes et paupiettes crus, panés ou non Rôtis
cuits, entier ou tranchés et paupiettes cuites ou précuites grammes
Viande
crue séparée mécaniquement
Viande
cuite séparée mécaniquement |
-
5 5.10
5 3.10
6 10
6 3.10 |
-
3 10
10
3 5.10
10 |
-
5.10²
10²
3 10
10² |
-
30
10
10²
30
|
Absence
dans
Absence dans 1
Absence dans 25
Absence dans 1
Absence dans 25 grammes |
Article 5 :
Les
critères microbiologiques relatifs aux ovoproduits, pâtisseries et crèmes pâtissières
sont les suivants :
Désignation | Micro- organismes aérobies à 30°C (par gramme) | Coliformes à 30° C (par gramme) | Coliformes Fécaux (par gramme) |
Staphylo- coccus aureus (par gramme) |
Anaérobies Sulf. réducteurs à 46°C (par grammes) | Salmonelles
dans |
Pâtisseries, Ovoproduits pasteurisés |
5 3.10 5 10
- |
3 10
-
- |
1
10 (entérobact.)
- |
10²
10²
- |
10
-
- |
Absence
Absence
Absence |
Article 6 :
Les
critères microbiologiques relatifs aux produits de la
pêche ci-dessous sont les suivants :
Désignation | Micro- organismes aérobies à 30°C (par gramme) | Coliformes Fécaux (par gramme) | Strepto- coques Fécaux (par gramme) | Staphilo- coccus auréus (par gramme) | Anaérobies Sulfito réducteurs à 46°C (par gramme) | Salmonelles |
Crustaxés entiers
Tous crustacés, ycompris crevettes Crevettes cuites décortiquées, réfrigérées et décortiquées congelées ou surgelées Coquillages Poissons tranchés Poissons tranchés Préparation à base Cuisses de grenouille
Escargots décoquillés |
5 10
3 10
5 10
-
5 10
5 5.10
5
5.10
- |
1
1
10
3.10²(1)
10
10²
10²
- |
-
-
-
3 2,5.10(2)
-
-
-
- |
-
-
10²
-
10²
10²
10²
- |
10
2
10
-
10
10
10
<103 |
Absence
Absence
Absence
Absence
Absence
Absence |
(1) pour 100 ml
(2) cette recherche est effectuée en cas de suspicion particulière,
selon les commémoratifs, dans 100 ml de mélange "chair-liquide
intervalvaire"
(3) la recherche de Vibrio parahemolyticus et/ou de Listeria dépend de la demande des pays importateurs. Le seuil fixé est de 102/g
Article 7 :
Désignation | Micro- organismes aérobies à 30°C | Coliformes Fécaux par ml | Salmonella dans 1000 ml | Strepto-
coques bétahéma-
tolytiques dans 0,1 ml |
Stabilité à l’ébullition | Acidité en g |
Au jour du
conditionnement
A la date limite de consommation |
4 9.10 5 9.10 |
10²
3 10 |
Absence
Absence |
Absence
Absence |
-
stable |
- Entre 1,4 et 1,8 |
Sont
retenus comme streptocoques bêta hémolytiques ceux appartenant aux groupes A,
B, C, G, et de Lancefield.
Article
8 :
Les
critères microbiologiques relatifs aux laits fermentés (yaourts, kefirs, etc…),
aux laits gélifiés, aux fromages frais pasteurisés, aux crèmes fraîches
pasteurisées, aux glaces et crèmes glacées, aux caséines et caséinates,
sont les suivants :
Désignation | Micro- organismes aérobies à 30°C (par gramme) | Colifor-
mes à 30°C (par gramme) |
Colifor-
mes Fécaux (par gramme) |
Staphylo- coccus aureus (par gramme) | Salmonella dans 25 grammes | Acidité
exprimée en acide lactique dans la partie non |
Laits fermentés
(yaourt kéfir)
Laits gélifiés et laits emprésurés aromatisés Fromage frais Crèmes de consommation pasteurisées
Glaces et crèmes glacées
Caséines caséinates |
-
3 10
-
4 3.10 phosphatase négative
5 3.10
4 3.10 et flore thermophile 3 5.10 |
10
10
10 Conditionnée 10 vrac 100
10²
Absence 0,1 g |
1
1
1 1
1
-
|
-
-
10 10
10
- |
Absence
Absence
Absence Absence
Absence
- |
-
-
- ≤ 2,5
-
- |
Article
9 :
Les
conserves à base de denrées animales ou d'origine animale, quelle que soit la
nature de leur emballage, doivent satisfaire à des épreuves permettant de vérifier
leur stabilité.
Ne
doivent pas être soumis à ce contrôle les boites métalliques ou les bocaux
en verre à couvercles déformables présentant des défauts majeurs tels que
bombement, flochage, fuitage. Il en va de même pour les conserves présentées
en emballage en matière plastique ou complexes métalloplastiques qui présenteraient
une modification apparente de l'emballage.
Les
épreuves comportent les opérations suivantes:
Etuvage
d'individus à 37 °C (+ 1°C) durant sept jours et à 35°C (+ 1°C) durant dix
jours
Etuvage
d'individus à 55°C (+ 2°C) durant sept jours
A
l'issue de ces épreuves, aucun bombement ou fuitage ne doit être constaté.
Une
appréciation de la variation du PH entre les unités étuvées et des unités
non étuvées témoin, laissées à la température du laboratoire pendant les
durées précitées, cette température devant être cependant inférieure à 25°C.
la variation de PH ne doit pas dépasser 0,5 unité.
Une
appréciation de la flore microbienne entre unités étuvées et non étuvées,
effectué de la manière suivante: soit n le nombre de micro-organismes dénombrés
sur 20 champs microscopiques observés sur une boite incubée, et n0 le nombre
de micro-organismes dénombrés sur une boite non incubée, le rapport n/n0 doit
être inférieur à 100.
En
cas de doute, et notamment lors du contrôle de certains produits de la pêche,
un examen bactériologique conduit avec toute la rigueur technique requise est
effectué.
Article
10 :
Les
critères microbiologiques relatifs aux semi-conserves à base de denrées
animales ou d'origine animale sont les suivants :
Désignation | Micro- organismes aérobies à 30°C (par gramme) | Coliformes (par gramme) | Staphylo- coccus aureus (par gramme) | Anaérobies
Sulfito-réducteurs
à 46°C (par gramme) |
Salmonella
dans 25 grammes dans
0,1 ml |
Semi-conserves
pasteurisées (1)
Semi-conserves non pasteurisées (1) - Rollmops, hareng saurs, anchois, au sel ou à l'huile. - Saumon fumé, haddock et autres poissons légèrement salés et fumés |
4 10
5 10
6 10 (3)
|
Absence
Absence
Absence
|
Absence
Absence
1
|
Absence
Absence (2)
Absence
|
Absence
Absence
Absence
|
(1) revivification de la suspension mère pendant deux heures à la température du laboratoire pour les semi-conserves pasteurisées e pendant trente à quarante cinq minutes pour les semi-conserves non pasteurisées.
(2) Cas particulier des anchois en saumure : anaérobies sulfito-réducteurs à 46°C : moins de 10 par gramme
(3) Dénombrement en milieu à l'eau de mer ou à défaut à l'eau de salinité 35 p 1000 et à température d'incubation de 20°C pendant cinq jours.
Article
11 :
Les
critères du présent arrêté, vérifiés selon les dispositions décrites en
annexe, sont ceux des laboratoires officiels et des laboratoires choisis par les
responsables d'entreprise lorsque les conditions d'hygiène dans lesquelles sont
réalisées les opérations de réception, de transformation, de
conditionnement, d'entreposage et de transport des denrées énumérées aux
articles précédents font l'objet de contrôles obligatoires.
Article
12 :
Le
Directeur des services vétérinaires est chargé de l'application du présent
arrêté qui sera enregistré, publié au Journal Officiel de la République, et
communiqué partout ou besoin sera.
Fait
à Djibouti, le 23 septembre 2000.
Le
Président de la République,
chef
du Gouvernement
ISMAÏL
OMAR GUELLEH
ANNEXE
I
Observations
:
Les
valeurs indiquées dans les tableaux du présent texte correspondent aux niveaux
de contamination microbienne qu'il est habituel d'attendre de produits fabriqués,
transportés et distribués dans des conditions de bonnes pratiques
professionnelles en matière d'hygiène.
1.
Echantillon pour laboratoire et technique de prise d'essai
1.1
Echantillon pour laboratoire
La
taille de l'échantillon pour laboratoire d'un produit de même nature doit être
comprise comme suit:
Portions
unitaires de viande et denrées visées aux articles 2 et suivants tant au
niveau de la fabrication que des points de vente: si possible, au moins cinq
unités;
Conserves:
cinq unités;
Coquillages:
nombre suffisant pour obtenir au laboratoire cinq fois au moins 25 grammes de
chair et de liquide inter-valvaire.
Nota.
1 – le laboratoire doit disposer, pour conduire les analyses complètes,
d'environ 500 grammes de produits, soit cinq fois 100 grammes. Ces 100 grammes
peuvent être fournis par une ou plusieurs pièces.
2
- cas particulier – lorsqu'il s'agit d'une production artisanale pour laquelle
le prélèvement de cinq échantillons peut s'avérer trop important au regard
de la quantité fabriquée, il pourra être procédé à un étalement dans le
temps de la prise de ces échantillons.
Toutefois,
dans l'éventualité où les premiers résultats se révéleraient d'emblée non
satisfaisants, il serait procédé au prélèvement simultané de cinq échantillons.
1.2
technique de prise d'essai
La
prise d'essai destinée à la préparation de la suspension mère et des
dilutions décimales porte:
Sur
les parties superficielles et profondes, notamment pour les produits en
tranches, hachés, divisés, pour les plats cuisinés à l'avance;
Sur
la partie profonde du produit pour les viandes (pièces), les produits de
charcuterie (pièces) et les poissons entiers, après cautérisation de la
surface.
Pour
les produits laitiers et selon la nature des produits, elle porte sur le produit
homogénéisé ou sur les parties superficielles et profondes.
Dans
le cas d'examens microbiologiques, à la suite de toxi-infections alimentaires,
il est nécessaire de pratiquer la recherche des germes pathogènes, toxicogènes
et/ou de leurs toxines, aussi bien en surface qu'en profondeur.
2.
Interprétation des résultats
Remarque.
– Il convient de retenir que la valeur des méthodes de dénombrement
microbien n'est pas absolue, quelle que soit la nature des milieux de culture
utilisés. Il est généralement admis que la variabilité peut atteindre _ log.
Avec les milieux solides et 1 log. Avec les milieux liquides.
2.1
Plan à trois classes
Principe:
Ce
plan est ainsi désigné parce que les résultats des examens interprétés sur
cette base permettent de fixer trois classes de contamination:
Celle
inférieure ou égale au critère m;
Celle
comprise entre le critère m et le seuil M;
Celle
supérieure au seuil M;
m:
critère fixé au présent texte. Tous les résultats égaux ou inférieurs sont
considérés satisfaisants;
M:
seuil limite d'acceptabilité, au-delà duquel les résultats ne sont plus
considérés comme satisfaisants, sans que pour autant le produit soit considéré
comme toxique. Les valeurs de M sont fixées à:
M
= 10 m lors du dénombrement effectué en milieu solide;
M
= 30 m lors du dénombrement effectué en milieu liquide;
n:
nombre d'unités composant l'échantillon;
c:
nombre d'unités de l'échantillon donnant des valeurs situées entre m et M.
Application
pratique (tenant compte de variations liées à la technologie micro-biologique,
remarque supra):
La
qualité du lot est considérée comme satisfaisante ou acceptable en
application de l'article 1er du présent texte lorsque aucun résultat ne dépassant
M:
a)Les
valeurs observées sont:
≤
3 m lors d'emploi de milieu solide;
≤
10 m lors d'emploi de milieu liquide;
qualité satisfaisante
b)
Les valeurs observées sont comprises
Entre
3 m et 10 m (=M) en milieu solide;
Entre
10 m et 30 m (=M) en milieu liquide;
qualité acceptable
Et
c/n est ≤ 2/5 avec le plan n = 5 et c = 2
(ou
tout autre plan d'efficacité équivalente
ou
supérieure)
Les
résultats sont considérés comme non satisfaisants:
a)
Lorsque c/n est > 2/5;
b)
Dans tous les cas où des valeurs supérieures à M sont observées. Cependant,
le seuil de dépassement pour les micro-organismes aérobies à + 30°C, alors
que les autres critères sont respectés, doit faire l'objet d'une interprétation,
notamment pour les viandes, volailles et produits crus.
Lorsque
les valeurs sont supérieures à M, les résultats sont considérés comme non
satisfaisants. Mais il est bien évident qu'au-delà d'un certain ordre de
grandeur, la notion de toxicité s'impose de plus en plus; en tout état de
cause, le produits doit être considéré comme toxique ou corrompu lorsque la
contamination atteint la valeur microbienne valeur S qui est fixée dans le cas
général à m.103. Pour Staphylococcus aureus cette valeur S ne doit jamais excéder
5.104. Les tolérances liées aux techniques d'analyse ne sont pas applicables
aux valeurs de M et de S.
2.2
Plan à deux classes
Ce
plan est ainsi désigné car les résultats des examens interprétés sur cette
base permettent de déterminer seulement deux classes de contamination. Ce type
de plan, qui n'accepte aucune tolérance, même de caractère analytique,
correspond le plus souvent aux expressions:
"Absence
dans": le résultat est considéré comme satisfaisant;
"Présence
dans": le résultat est considéré comme non satisfaisant; le produit est
déclaré impropre à la consommation.
En
outre, dans certains cas particuliers mentionnés aux articles 2 et 5 du présent
arrêté, il est fait application du plan à deux classes, avec tolérance
analytique.
Nota
– ce plan est en particulier applicable aux contaminations par salmonella.
Cependant, pour les volailles, lorsqu'il s'agit de contamination superficielle,
le lot est considéré comme satisfaisant lorsque le rapport d/n ≤ 5, d étant
le nombre d'unités de l'échantillon dont les résultats sont positifs.
2.3
Cas particulier des conserves
Lorsque
les conserves à base de denrées animales et d'origine animale ne répondent
pas aux épreuves de stabilité fixées à l'article 9 du présent texte, la
transposition au lot d'origine ne pourra intervenir que dans la mesure où un
plan d'échantillonnage préalablement défini aura été mis en œuvre.
3.
Dispositions particulières relatives aux échantillons soumis à la congélation
en vue d'une analyse microbiologique différée
Remarque
– La congélation d'un échantillon (plat cuisiné, viande hachée…)
provoque une diminution plus ou moins sensible, selon les cas, du nombre de
germes servant de test pour le jugement de la qualité microbiologique telle que
définie par la réglementation en vigueur.
Le
fait de congeler un échantillon d'un produit réfrigéré peut être de nature
à provoquer certains litiges (échantillon réfrigéré jugé inacceptable,
alors qu'un échantillon du même lot, mais ayant subi une congélation, se révèle
satisfaisant au plan bactériologique). Il convient, pour éviter au maximum
l'apparition de cette disparité, de traiter les échantillons dans les
conditions suivantes, lorsqu'ils doivent être congelés et conservés en l'état,
préalablement à leur analyse bactériologique.
3.1
modalités de congélation et de décongélation
a)
Congélation précoce conduite de manière à atteindre la température de –
18°C le plus rapidement possible;
b)
Stockage et transport à une température ≤ - 18 °C. La durée du
stockage ne doit pas excéder un mois.
c)
Décongélation rapide à l'air ambiant à une température de l'ordre de
20 °C pendant le temps le plus court possible (inférieur à trois heures) sans
dépasser le stade où la consistance du produit permet le prélèvement nécessaire
à la préparation de la suspension mère (température voisine de 0 °C).
ANNEXE
II
Méthodes
générales d'analyse bactériologique
1.
Préparation de l'échantillon pour essai – Prise d'essai
Chaque
fois qu'il est nécessaire, il est procédé à une homogénéisation du produit
à l'aide de techniques et d'appareils appropriés. (broyeur-homogénéisateur
par exemple).
Les
prises d'essai sont effectuées sur l'échantillon homogénéisé en tenant
compte de la nature des produits et des opérations analytiques à conduire.
Elles sont en principe de 10, 25 ou 50 grammes (dans ce dernier cas 25 grammes
sont réservés à la recherche des salmonelles).
2.
suspensions mères et dilutions décimales
dans
un flacon taré contenant 90, 100 ou 225 ml de diluant, introduire aseptiquement
10 ou 25 grammes de produit afin de réaliser des suspensions au 1/5 ou 1/10.
Homogénéiser.
Les
diluants suivants sont préconisés:
2.1
cas général
Tryptone
sel:
Tryptone………………………………………………
1 g
Chlorure
de sodium…………………………………
8,5 g
Eau
distillée………………………………………….
1000 ml
Préparation:
chauffer lentement jusqu'à complète dissolution, ajuster si nécessaire le PH
à 7,0 (+ 0,1), répartir, puis stériliser vingt minutes à 121 °C + 1.
Eau
peptonée tamponnée:
Bacto
pepone………………………………………….
20 g
Chlorure
de sodium……………………………………
5 g
Phosphate
disodique………………………………….
9 g
Phosphate
monopotassique…………….……………
1,5 g
Eau
distillée…………………………………………….
1000 ml
Stériliser
à 121 °C + 1 pendant vingt minutes; PH final: 7,2
2.2
Cas des produits laitiers
Eau
peptonée pour le yaourt.
Tryptone-sel
pour les laits gélifiés et emprésurés.
Phosphate
dipotassique à 2 p 100 (PH final entre 7,4 et 7,6) pour les crèmes fraîches,
les fromages frais et les caséinates.
A
partir des suspensions mères, préparer les dilutions décimales en utilisant
le diluant correspondant au produit à analyser.
3.
Revivification
A
l'exclusion des produits laitiers, si le produit a subi un traitement thermique
ou s'il a été congelé ou encore s'il renferme des sels pouvant exercer une
action inhibitrice (NaC1, NaNO3, NaNO2…) après homogénéisation laisser le
flacon à la température de laboratoire (20 °C + 2 °C) pendant trente à
quarante cinq minutes (optimum quarante minutes).
4.
dénombrement des micro-organismes aérobies à 30 °C
Porter
en double 1 ml de l'échantillon pour essai s'il est liquide ou 1 ml de la
suspension mère dans le cas des autres produits dans les boites de Pétri stériles
(90 à 100 mm de diamètre). Pratiquer de la même manière à partir des
dilutions retenues en fonction du produit à analyser.
Couler
dans chaque boite 15 ml de gélose pour dénombrement préalablement fondue et
ramenée à 47 °C (+ 1 °C). bien mélanger inoculum et milieu. Laisser
solidifier.
L'ensemble
de ces opérations ne doit pas durer plus de quinze minutes.
Nota.
Il est indispensable d'employer des pipettes stériles changées pour chaque
dilution et d'homogénéiser à l'aide d'un agitateur pour tubes à essai.
Placer
les boites retournées dans une étuve à 30 °C (+ 1 °C). Les laisser
soixante-douze heures (+ trois heures).
Ne
retenir pour le dénombrement que les boites contenant moins de 300 colonies (et
plus de 30 si possible).
En
cas d'expertise, se conformer aux dispositions de la norme Afnor V 08-011.
5.
Dénombrement des Enterobacteriaceae
Le
dénombrement s'effectue en gélose au cristal violet, rouge neutre, bile,
glucose (V.R.B.G.).
A
partir du flacon contenant la suspension mère (1/5 ou 1/10) porter 1 ml dans
deux boites de Pétri stériles (90 à 100 mm de diamètre).
Couler
12/13 ml de gélose sélective fondue et ramenée à 47 °C (+ 1 °C). Bien mélanger
inoculum et milieu. Laisser solidifier. Couler en surface environ 9 ml de milieu
sélectif vierge ramené à 47 °C (+ 1 °C). Laisser solidifier et placer les
boites retournées dans une étuve
à 30 °C (+ 1 °C). Les laisser vingt-quatre heures (+ deux heures). Dénombrer
les colonies violettes et vérifier la nature de ces colonies (les entérobactéries
sont oxydases et fermentent le glucose).
6.
Dénombrement des coliformes
Les
coliformes sont dénombrés soit en milieu solide (gélose désoxychloate
lactose), soit en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable (N.P.P.)
à l'aide du bouillon lactosé billé au vert brillant réparti dans des tubes
contenant des cloches de Durham (10 ml de bouillon par tube).
6.1
le dénombrement en milieu solide s'effectue à partir du produit s'il est
liquide, des suspensions mères dans les autres cas et des divisions décimales
retenues selon la nature du produit en portant 1 ml dans deux boites de Pétri
stériles (90-100 mm de diamètre).
Couler
ensuite 13 ml environ de gélose désoxychlorate lactose fondue et ramenée à
47°C (+ 1 °C). Bien mélanger inoculum et milieu. Laisser solidifier.
Recouvrir d'une couche de gélose désoxychlorate lactose vierge (9 ml environ),
laisser solidifier.
Porter
les boites retournées à l'étuve à 30°C (+ 1 °C). Les laisser vingt-quatre
heures (+ deux heures).
Dénombrer
les colonies caractéristiques rouge foncé d'un diamètre supérieur à 0,5 mm
en prenant si possible une série de deux boites où le nombre est compris entre
15 et 150.
6.2
le dénombrement en milieu liquide s'effectue en transférant dans trois tubes
de milieu sélectif 1 ml du produit s'il est liquide ou de la suspension mère,
puis en opérant de la même manière pour les suspensions suivantes:
Bien
mélanger inoculum et milieu.
Porter
les tubes à l'étuve à 30°C (+ 1 °C). Les laisser vingt-quatre-quarante huit
heures (+ deux heures).
Pour
chaque dilution (y compris suspension mère et produit liquide), compter les
tubes positifs c'est à dire ceux qui présentent un dégagement gazeux dans la
cloche de Durham et calculer le nombre le plus probable à l'aide des tables de
référence.
En
cas d'expertise, se conformer aux indications des normes Afnor V 08-015 et V
08-016.
7.
dénombrement des coliformes fécaux (entérobactéries fermentant le lactose
aux températures élevées)
Il
s'effectue:
Soit
en milieu solide, selon les mêmes modalités que pour les coliformes mais en
portant les boites de Pétri ensemencées à 44°C (+ 0,5°C) durant
vingt-quatre heures (+ deux heures).
Soit
en milieu liquide (technique du N.P.P.) en repiquant à l'aide d'une anse bouclée
les tubes de bouillon lactosé billé au vert brillant trouvés positifs lors du
dénombrement des coliformes, dans les tubes de ce même bouillon.
Les
tubes ensemencés sont incubés en bain chaud à 44 °C (+ 0,5°C)
vingt-quatre-quarante-huit heures (+ deux heures).
Compter
les tubes positifs, c'est à dire ceux présentant un dégagement gazeux dans
les cloches de Durham et calculer le nombre le plus probable à l'aide des
tables de référence.
8.
Dénombrement de Staphylococcus aureus
A
partir du produit s'il est liquide, de la suspension mère et/ou des dilutions
retenues selon la nature du produit, porter 0,1 ml sur deux boites de Pétri
contenant du milieu de Baird Parker et étaler l'inoculum à l'aide d'un étaleur
de verre stérile sur la surface préalablement séchée du milieu. Ce dernier
ne doit pas avoir plus de quarante-huit heures et doit être conservé au froid.
Pour les produits laitiers, ensemencer 1 ml en milieu de Baird Parker.
Les
boites sont incubées à l'étuve à 37 °C (+ 1 °C) pendant vingt-quatre puis
quarante-huit heures.
Dénombrer
les colonies caractéristiques c'est à dire noires, brillantes, d'un diamètre
compris entre 0,5 et 2 mm présentant un liseré blanc opaque, entourées d'une
auréole d'éclaircissement du milieu. Certains staphylocoques retrouvés dans
les produits laitiers peuvent donner des colonies noires dépourvues d'auréole.
Repiquer
au moins cinq colonies pour les soumettre aux tests de la coagulase ou de la
thermonucléase.
9
dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs à 46°C
Ce
dénombrement peut s'effectuer en milieu S.P.S., T.S.N., ou T.S.C. (Tryptone
Sulfite Cyclosérine), ce dernier milieu étant recommandé.
Préparation
du milieu base:
Tryptone 15
g
Soytone
5 g
Extrait
de levure
5 g
Métabisulfite
de sodium anhydre (S2O5Na2)
1 g
Citrate
de fer ammoniacal
1 g
Agar-agar
12 à 18 g
Eau
1000 ml
Ajuster
le Ph de sorte qu'après stérilisation, il soit à 7,6 + 0,1 à 25°C. Répartir
en tubes de 20 X 200 à raison de 19 ml par tube. Stériliser quinze minutes à
121 °C + 1 °C. Conserver à 4-5 °C au maximum quinze jours.
Solution
de D cyclosérine:
D
cyclosérine cristallisée
4 g
Eau
100 ml
Dissoudre
la cyclosérine dans l'eau. Stériliser par filtration
Préparation
de milieu complet:
Au
moment de l'emploi, ajouter la solution de D cyclosérine pour obtenir une
concentration finale de 400 µgrammes/ml, soit 1 ml pour 100 ml de milieu.